Hipogonadyzm spowodowany substytucją pojedynczego aminokwasu w podjednostce hormonu luteinizującego cd

Klony LH. i CG. rozróżniono przez hybrydyzację przez filtrację z sondami oligonukleotydowymi, które były specyficzne dla niehomologicznych regionów genów. 11 Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono za pomocą metody kończenia łańcucha. 12 Genotypy potwierdzono przez sekwencjonowanie co najmniej sześciu klonów. Charakterystyka właściwości funkcjonalnych zmutowanego hormonu luteinizującego
Zmutowane i normalne geny LH. subklonowano do wektora ekspresyjnego pM2., jak opisano powyżej. Sekwencja genu LH. rozciąga się od 32 bp powyżej miejsca inicjacji translacji do 101 bp poniżej kodonu stop i obejmuje sygnał poliadenylacji. Subklony zsekwencjonowano w celu potwierdzenia, że błędy polimerazy Taq nie wystąpiły podczas amplifikacji PCR. Wektor ekspresyjny pM2. / LH. zawierał geny LH. i LH., każdy pod kontrolą oddzielnego promotora wirusa mysiego-mięsaka Harvey a. Plazmid zawierał także gen markera selekcyjnego pod względem oporności na neomycynę.13 Komórki chomika chińskiego-jajnika (American Type Culture Collection, Rockville, MD) utrzymywano w zmodyfikowanej pożywce Eagle, która zawierała 5 procent surowicy płodowej (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY) i została uzupełniona penicyliną (100 U na mililitr) i streptomycyną (100 .g na mililitr). Komórki transfekowano techniką fosforanu wapnia. Stabilne klony selekcjonowano za pomocą genetycyny (0,30 mg na mililitr) (GIBCO Laboratories), analogu neomycyny. Aktywność hormonu luteinizującego w pożywce z hodowanych komórek mierzono za pomocą testu radioimmunologicznego i za pomocą testu immunoradiometrycznego, w którym stosuje się surowicę odpornościową swoistą dla LH. i LH..15. Reaktywność niezwiązanego LH. i LH. była w tym teście mniejsza niż 5 procent. Przeprowadzono testy radioreceptorów w celu zmierzenia zdolności nieznakowanego hormonu do hamowania wiązania hormonu znakowanego radioaktywnie do receptora hormonu luteinizującego.
Wyniki
Charakterystyka mutacji w LH.
Białko LH. jest kodowane przez pojedynczy gen, który znajduje się w sąsiedztwie kilku wysoce homologicznych genów CG. i pseudogenów na chromosomie 19.9. Strukturę i rozmieszczenie genów LH. i CG. u kilku dotkniętych członków rodziny oraz u niespokrewnionych zdrowych osobników oceniano za pomocą analizy Southern blot. . Obecny był gen LH. i każdy z sześciu genów CG. i nie było dowodów na rearanżację genu u któregoś z dotkniętych członków rodziny (dane nie przedstawione).
Figura 3. Figura 3. Sekwencja DNA mutacji w genie LH.. Wskazano mutację, która zmienia kodon 54 z glutaminy na argininę. Tabela 2. Tabela 2. Podsumowanie mutacji w klonach z amplifikacją PCR genów LH. i CG. od członków rodziny z mutacją w LH.. Następnie zastosowano PCR do klonowania poszczególnych genów LH. i CG. (ryc. 2). Geny LH. odróżniono od strukturalnie podobnych genów CG. za pomocą swoistych dla sekwencji oligonukleotydów.11 W probandzie (IV-1) w genie LH. zidentyfikowano podstawienie jednozasadowe. Ta substytucja zamienia kodon 54 z glutaminy na argininę (Fig. 3). Mutację zweryfikowano w trzech niezależnych reakcjach PCR
[przypisy: apap extra ulotka, kartoflarnia toruń, pantamed olsztyn ]